肿瘤相关成纤维细胞（CAF）在TME中的累积与结直肠的进展和复发密切相关成人xfplay，也与肿瘤免疫响应性密切相关。而趋化因子CXCL12（也被称作基质细胞滋生因子1，SDF1）巨额由CAF分泌，与CXCR4或CXCR7合伙后不错招募特定的免疫细胞亚群而导致TME的免疫扼制情状，进而促进肿瘤进展。可是调控TME中CXCL12水平的要素有待计划。
另一方面，生酮饮食（KD）在多项基础计划中被证实对肿瘤滋长有扼制作用，并被不雅察到对结肠癌、玄色素瘤、肾癌、非小细胞肺癌等的免疫查验点封闭（ICB）调养起到积极作用。可是生酮作用在免疫扼制微环境中的动态变化和具体机制仍然不澄澈。
计划舍弃1.KD减少免疫扼制细胞的蓄积，加多TME中NK细胞、T细胞的数目
计划者通过对免疫功能完备的C57肠癌小鼠和免疫功能谬误的肠癌裸鼠喂养KD，发现KD导致的肿瘤扼制作用可能与TME中免疫情状相关（图1AB，补图1C）。随后对C57小鼠肿瘤组织进行流式分析，也发现KD喂养的小鼠TME中T细胞（尤其是CD8 T细胞）浸润更多（图1C-E），而巨噬细胞，尤其是M2型巨噬细胞减少（图1F、G）。
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图1
为了进一步细则KD造就的肿瘤浸润免疫亚群的更正格局，计划者对肿瘤浸润CD45 白细胞进行了单细胞RNA测序(scRNA-seq)并进行聚类分析，细则了11类细胞簇，并得到了与流式分析一样的舍弃，此外还不雅察到KD组的小鼠TME中NK细胞增多、CD4 Treg细胞减少（图1H-K）。
这些舍弃教导生酮作用扼制了TME免疫扼制情状的出现，增强了抗肿瘤免疫响应。
2.生酮作用的加多扼制了CAF中CXCL12的抒发
之前有报说念走漏，CAF可能通过分泌CXCL12参与TME中免疫扼制情状的保管。为了谈判生酮作用扼制免疫扼制情状是否与CAF相关，计划者们构建了过抒发生酮酶HMGCS2的原代东说念主CAF（hCAF-05和hCAF6231），并对其进行了RNA测序，发现过抒发HMGCS2的CAF中CXCL12的mRNA抒发减少；且在不影响CAF生物象征物ACTA2、S100A4和MMP4的情况下，酮体β-羟丁酸（βHB）产生增多（图2A），对细胞裂解液、细胞上清液进行RT-PCR、ELISA发现CXCL12卵白水平也出现着落（图2B、C）。而过抒发HMGCS2-C166A(酶活突变)的CAF中CXCL12mRNA的抒发、细胞裂解液中βHB抒发并无影响（图2A）。另一方面，赐与CAFβHB科罚后，其CXCL12mRNA和卵白抒发彰着受到扼制（图2D、E）。而在赐与KD饮食的小鼠原代CAF中相似不雅察到CXC12mRNA水平的裁减（图2F）。而βHB科罚并不影响平日结肠成纤维细胞内CXCL12mRNA的水平。这教导了生酮作用对CAF内CXCL12抒发的特异性扼制。
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图2
3.KLF5介导CXCL12抒发的调控
av论坛在对过抒发HMGCS2的CAF进行RNA-seq的舍弃还教导了KLF5mRNA的裁减，RT-PCR相似证实了这小数（图3A、B）。在对东说念主的原代CAF和小鼠CAF进行βHB科罚后，计划者们发现KLF5在卵白水平也出现了着落（图3C）。因有报说念教导，βHB不错算作I类组卵白去乙酰化酶（HDACs）的内源性扼制剂，从组卵白H3赖氨酸9（H3K9ac）乙酰化的加多中不错看出，βHB扼制了CAFs中HDAC的活性，而使用I型HDACs的外源性扼制剂丁酸钠（NaBT）或HDAC1的弃取性扼制剂MS-275科罚hCAF-05，或对hCAF-05进行HDAC1进行敲低科罚后，细胞的KLF5(而非KLF4)抒发受到扼制（图3C）。这些舍弃教导生酮作用的加多通过扼制CAF的HDAC1来扼制其KLF5抒发。
接着，计划者们驱动谈判KLF5是否调控CXCL12抒发。对hCAF-05进行过抒发KLF5腺病毒（Adv-KLF5）感染后，细胞CXCL12的mRNA和卵白抒发水平彰着加多（图3D、E），而对过抒发KLF5的CAF进行βHB科罚，CXCL12的mRNA抒发并未裁减（图3D）。另一方面，对CAF的KLF5进行敲降或外源性扼制后发现其CXCL12mRNA、卵白抒发裁减（图3F-H）。这些舍弃教导生酮作用通过扼制KLF5抒发来扼制CXCL12抒发。
KLF5不错通过与启动子原件合伙而促进靶基因的转录，其艰辛的合伙序列为5’-GGGGTGGG-3’。合伙以往计划，计划者们揣度了KLF5与CXCL12启动子合伙的两个基序，并通过CAF进行了染色质免疫共千里淀（ChIp）对揣度位点进行了阐发，且发现KLF5基序1主要与CXCL12启动子区域进行合伙，而HMGCS2过抒发能使两者的合伙松开（图3I、J）。对CXCL12启动子区域进行克隆后，将其与KLF5过抒发质粒进行共孵，发现CXCL12启动子活性彰着加多，而若是KLF5合伙基序1被删除，其造就的CXCL12启动子活性加多的成果也随之隐藏（图3K、L）。这些舍弃教导KLF5通过合伙CXCL12启动子造就其转录。
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图3
4．加多生酮扼制CAF滋长
将不同的CAF用βHB科罚6天，发现CAF的增殖受到扼制，而过抒发HMGCS2也能扼制CAF的增殖（图4A-D），具体阐扬为G0/G1期拦阻，以及p53、p21Waf1抒发的加多（图4E、F）。在体内计划中，用WB检测CAFmarker α-SMA，发现KD喂养后荷瘤小鼠TME内CAF减少（图4G、H）。
而前述舍弃教导了生酮作用与KLF5调控CAF中CXCL12抒发的内在关联，因此接着计划者们通过对CAF进行过抒发KLF5和βHB科罚，发现酮体导致的CAF滋长扼制被KLF5过抒发逆转，而KLF5敲低导致了CAF的增殖减少（图4I、J）。
以上两个舍弃证实，CAF的增殖受到HMGCS2/βHB/KLF5信号的调控。
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图4
5.结直肠癌患者的生酮处于下调情状
以上舍弃教导KLF5依赖的CXCL12抒发对TME的免疫扼制情状起到艰辛作用，而生酮不错扼制这种情状的产生。接着计划者们将眼神转到临床，发现βHB、HMGCS2在大部分结直肠癌患者组织内下调，而CXCL12高抒发（图5A-C）。对肠癌肝更动灶组织进行免疫组化分析，发现HMGCS2下并吞KLF5、CXCL12上调存在相关性（图5D）。
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图5
6.KD扼制肿瘤内CXCL12抒发，增强PD-1阻断调养的疗效，扼制了肿瘤的滋长和更动
基于以上舍弃，计划者们选定KD喂养结肠癌荷瘤小鼠，发现KD小鼠βHB抒发在血浆和肿瘤内皆彰着飞腾，CXCL12抒发彰着减少（图6A-E）。因为有计划教导CXCL12与结肠癌ICB耐药相关，因此计划者们谈判KD与ICB疗效之间的关系，发现KD喂养小鼠在PD-1阻断调养中赢得了更好的肿瘤扼制疗效（图6F-J）。
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图6
由于CXCL12CXCR4/CXCR7还被报说念与肿瘤的更动相关，计划者进一步计划了KD饮食与结肠癌更动间的关系。体外实践发现过抒发HMGCS2的CAF细胞的培养上清液不错扼制结肠癌细胞的迁徙（图7A-C）；小鼠实践发现KD饮食减少了小鼠结肠癌的肝、肺更动，且在KD喂养的荷瘤小鼠更动灶中βHB抒发升高，CXCL12抒发着落（图7D-G）。
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图7
以上舍弃教导KD扼制肿瘤内CXCL12抒发，增强PD-1阻断调养的疗效，扼制了肿瘤的滋长和更动。
计划论断酮生成减少是结直肠癌的象征之一，而酮生成加多不错扼制CAF中KLF5依赖的CXCL12抒发，从而扼制TME中的免疫扼制情状，增强了PD-1阻断的调养作用，扼制了结直肠癌的肝肺更动。教导了使用KD造反CRC免疫违背和更动的潜在益处。
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保举根由1.本计划将肿瘤计划边界的热门——CAF、肿瘤代谢、免疫调养合伙起来，系统地阐发了三者的关系，相关实践念念路和实践圭臬值得鉴戒学习；
2.教导CXCL12信号可能是结直肠癌免疫调养的疗效揣度因子，具有临床更动价值；
3.教导饮食结构或对肿瘤免疫调养起到一定作用，对临床实施有一定的指挥景仰。
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